Surface-grown MIPs towards the Miniaturization of Biosensors

Abstract

A chemical sensor is a powerful tool to improve diagnostics and therapeutics in the clinical field. For example, real-time monitoring of in vivo analyte concentrations via novel developed chemical sensors can add to the understanding of pathologies and the progression of patients. In order to accomplish this, there is a need for production routes that allow miniaturization of these sensors, which make them suitable for medical applications. Antibodies are frequently used in chemical sensors as they are well-known for their specific interaction with target molecules. Their synthetic counterparts are molecularly imprinted polymers (MIPs), which specifically interact with an analyte based on a variety of chemical interactions. The use of synthetic materials over their biological counterparts guarantees a better shelf-life, low production cost and good survival rate in harsh environmental conditions. The building blocks for MIPs (monomers) exhibit specific chemical functionalities, like acids. Synthesis routes have to be carefully chosen to be compatible with this type of monomer and preserve its function as recognition element. Miniaturization of MIP-based sensors is enabled through the production of direct surface-grown MIPs (instead of MIP particle deposition). Furthermore, by using light sources to initiate the polymerization reaction, spatial and temporal control can be achieved. By choosing a reversible deactivation radical polymerization (RDRP), better control over the polymer film can be achieved, with concomitant improved binding efficiencies for the MIPs. The first step in this thesis was to optimize a photo-mediated RDRP suitable for the production of surface-grafted polymers using monomers relevant for MIPs. Secondly, the specific reaction condition had to be determined to produce a working MIP film and characterize its sensor abilities. To start, a synthesis route was optimized for the polymerization of methacrylic acid (MAA), which is a monomer that is widely used for MIPs. This was achieved by using a metal-free, organocatalyzed, photo atom transfer radical polymerization (photoATRP). While this is considered impossible for a classical ATRP route, metal-free ATRP of methyl methacrylate (MMA), as a reference, and MAA were investigated in solution and continuous flow. This revealed that control over the molecular weight was directly assessed only at significant monomer conversions. At lower conversions, a confusing mismatch concerning the molecular weight was observed in gel permeability chromatography (GPC) and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). In addition, electrospray ionization mass spectrometry (ESIMS) revealed some loss of end-groups. Ultimately, PMAA brushes were successfully grafted from planar silicon wafers resulting in thin films of around 4 nm. This thickness is sufficient for the imprinting of analytes. The synthesis route described above was elaborated to graft cross-linked non imprinted polymer (NIP) films, copolymerizing MAA and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) from titanium substrates. Grafting was initiated by using a UV-laser, which provides initiation that is more efficient and allows for the production of more complex polymer patterns. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) revealed the real respective monomer contributions in the polymer film. By varying the monomer ratios, the threshold to incorporate MAA was observed to be at 2:1 MAA:EGDMA. This is essential to have a working MIP sensor. After grafting the polymer film in presence of the template analyte, histamine, the function of the MIP film was directly characterized with electro impedance spectroscopy (EIS). This nicely demonstrated the specific recognition of histamine with a limit of detection of 3.4 nM of histamine in phosphate buffer saline (PBS). As an alternative, surface initiated photoinferter using xanthates was investigated. In contrast to photoATRP, no catalyst is required. Photoiniferter is compatible with a vast library of monomers and its mechanism is comparable to photo reversible addition fragmentation degenerative chain transfer (RAFT) polymerization, but without the addition of exogenous radical initiators. This reaction is straightforward in a sense that only monomers and solvent are added to the activated substrates before irradiation by UV-light. The xanthates were successfully immobilized on a silicon wafer, as confirmed by ToF-SIMS. The grafting of poly(methyl acrylate) (PMA), a reference for MIP relevant acrylates, was confirmed via ToF-SIMS and XPS. FTIR revealed a continuing monomer conversion over reaction time up to 45 minutes. Atomic force microscopy (AFM) detected a film thickness of 25 nm after 30 minutes reaction time. However, significant reproducibility issues are observed which resulted in the grafting of polymer “mushrooms” instead of the desired smooth films. This indicates a low grafting density, which could be caused by partial degradation of the xanthate functionality or interference with the silanization process. The chemical pathways developed within this project can possibly serve as a route for the production of MIP films. However, the reproducibility issues need to be addressed before further conclusion about the reaction’s feasibility can be drawn. This project shows the chemistry is working and can possibly serve as a route to produce MIP films. As a side project, functional resins were developed for two-photo polymerization (2PP). 2PP is a popular tool to directly 3D print polymeric structures with high resolution.A2PP resin generally comprises cross-linkers and specific photoinitiators. In this project, an oligomer produced via RAFT polymerization (macroRAFT), was added. This induces a RAFT mechanism for 2PP while so far only free radical polymerization was reported. In this way a variety of post-modifications reactions are enabled and concomitant control over the mechanical and chemical properties of the 3D structures is allowed. Scanning electron microscopy (SEM) confirms the printing of 3D “X”-shaped structures with up to 10 mol% macroRAFT. Energy dispersive x-ray spectroscopy confirmed the presence of the trithiocarbonate. Preliminary data show promising results for the post-modification via aminolysis of the RAFT agents and subsequent Michael addition of polyethylene glycol acrylate. For a second side project, Morita-Baylis-Hillman (MBH) step growth polymerization was performed to produce densely functionalized oligomers. These MBH adducts were cross-linked in suspension using thiol-ene Michael addition reactions, yielding polymer microparticles. Degradability experiments proof the degradation of the polymer particles in basic media and cytotoxicity tests revealed good biocompatibility. As a proof of concept, the possibility to post modify the particles is displayed through the formation of imines, a popular bioconjugation reaction.

Een chemische sensor is een krachtige tool om de kwaliteit van diagnostische bepalingen en therapieën te verbeteren. Een voorbeeld hiervan is het real-time monitoren van in vivo analiet concentraties. Dit kan bijdragen tot een betere kennis omtrent pathologieën en de progressie van patiënten. Om dit te verwezenlijken is er nood aan syntheseroutes die het toelaten om zulke sensoren te miniaturiseren en dus inzetbaar te maken voor medische toepassingen. In chemische sensoren worden antilichamen frequent gebruikt als receptoren gezien deze bekend zijn voor hun specifieke herkenning en interactie met respectievelijk doelmoleculen. De synthetische tegenhangers van antilichamen zijn zogenaamde MIPs of moleculair ingeprente polymeren die de interactie met het doelmolecule aangaan op basis van verschillende chemische interacties. Het gebruik van synthetische materialen geeft als voordeel een verbeterde levensduur van het materiaal, een lagere productie kost en een goede compatibiliteit met de variëteit aan fysiologische condities. De bouwstenen voor MIPs (namelijk monomeren) bevatten enkele specifieke chemische functionaliteiten, zoals zuren. De syntheseroutes moeten afgesteld worden op deze types monomeer zodat hun eigenschappen met betrekking tot moleculaire herkenning worden behouden. De miniaturisatie van MIP gebaseerde sensoren wordt mogelijk gemaakt door het direct groeien van MIPs vanaf het oppervlak van een substraat i.p.v. het afzetten van MIP partikels waarbij voorgesynthetiseerde partikels worden geïmmobiliseerd. Daarbij wordt, door het gebruik van lichtbronnen ter initiatie van de polymerisatie reactie, een zowel ruimtelijke als temporele controle verkregen. Door gebruik te maken van een reversibele deactiveerbare radicalaire polymerisatie (RDRP) kan er een betere controle over de eigenschappen van de gegroeide MIP film worden bekomen. Dit gaat gepaard met verbeterde bindingseigenschappen van de MIPs. De eerste stap in deze thesis was om een foto-gemedieerde RDRP te optimaliseren voor de productie van oppervlak gegroeide polymeren, opgebouwd uit zure monomeren. Vervolgens werden de reactie condities aangepast om een functionele MIP sensor te kunnen produceren. Ten slotte werd de MIP sensor dan gekarakteriseerd. Eerst werd een syntheseroute geoptimaliseerd voor de polymerisatie van methacrylzuur (MAA) dat een veel gebruikt monomeer is voor MIPs. Dit doel werd bereikt door gebruik te maken van organogekatalyseerde foto atom transfer radical polymerization (ATRP). Ondanks dat klassieke ATRP initieel niet compatibel is met zure monomeren, werd dit metaal vrije alternatief getest voor de polymerisatie van methyl methacrylaat (MMA) en MAA in batch en in flow reactoren. Hieruit kon worden afgeleid dat controle over de moleculaire massa alleen bekomen kon worden bij hogere monomeer conversies. Bij lagere conversies werd er een mismatch waargenomen tussen GPC (gel permeability chromatography) en NMR (nuclear magnetic resonance). ESI-MS (electrospray ionization mass spectrometry) toont aan dat er geen volledig behoud van eindgroepen is. Uiteindelijk werden PMAA-ketens gegroeid vanaf siliciumoxide. De dikte van de polymeer film bedroeg ongeveer 4 nm. Deze dikte is voldoende om het inprenten van de uiteindelijke doelmoleculen mogelijk te maken. De hierboven aangehaalde syntheseroute werd vervolgens geoptimaliseerd voor het groeien van vernette polymeer filmen van titanium substraten, gebruik makend van MAA en ethylene glycol dimethacrylaat (EGDMA). De gebruikte lichtbron was een UV-laser die voorziet in een efficiëntere initiatie en het groeien van complexere polymeer patronen toelaat. Met XPS (x-ray photoelectron spectroscopy) en ToF-SIMS (time-of-flight secondary ion mass spectrometry) kon de werkelijke bijdragen van de respectievelijke monomeren worden achterhaald. Door de experimentele monomeer ratio’s vervolgens aan te passen werden de optimale condities vastgesteld rond 2:1 MAA:EGDMA. Dit gegeven is essentieel om een functionele MIP sensor te kunnen bekomen. Vervolgens kon een polymeer film gegroeide worden in aanwezigheid van het doelmolecule, nl. histamine. De werking van de MIP film werd rechtstreeks via impedantie gekarakteriseerd. Dit toonde de goede specificiteit van de sensor aan met een gemeten detectielimiet rond 3.4 nM van histamine in PBS. Als alternatieve syntheseroute werd ook fotoiniferter onderzocht. Bij fotoiniferter zijn er geen benodigde katalysatoren en de route is compatible met een grote verscheidenheid aan monomeren. De reactie is straight-forward in die zin dat, na het functionaliseren van het substraat, slechts monomeer en eventueel solvent dient toegevoegd te worden voordat deze blootgesteld worden aan de UV-bron. In dit project werden xanthaten geïmmobiliseerd op siliciumoxide substraten, zoals bevestigd door ToF-SIMS. Het groeien van methyl acrylaat ketens (PMA), die hier als referentie werden gebruikt, werd bevestigd door XPS en ToF-SIMS. Infrarood spectroscopie toonde vervolgens aan dat er een continue monomeer conversie was over tijd, tot 45 minuten. AFM (atomic force microscopy), nam een polymeer film waar met een dikte van 25 nm na 30 minuten reactietijd. Er werden echter problemen met de reproduceerbaarheid van de resultaten vastgesteld. In gelijkaardige condities werden ook “paddenstoelen” waargenomen i.p.v. van een homogene polymeer film. Dit zou verklaard kunnen worden door een lage densiteit van xanthaten aan het oppervlak. Mogelijk is dit te wijten aan een eventuele degradatie van de xanthaten of een verhinderde immobilisatie daarvan. Om uitspraken te kunnen doen over de haalbaarheid van dit project zouden eerst hiervoor verklaringen moeten worden gevonden. Het project toont echter aan dat het mogelijk is PMA te groeien door gebruik te maken van fotoiniferter, wat vervolgens impliceert dat dit onderzocht kan worden om van het oppervlak gegroeide MIPs te produceren. In een zij-project werd de ontwikkeling van functionele polymeerhars voor twee-foton polymerisatie (2PP) aangewend. 2PP is een populaire tool om polymere structuren te 3D-printen met hoge resolutie. Een 2PP hars bestaat meestal uit cross-linkers (die zorgen voor vernetting) en specifieke initiators. In dit project werd een oligomeer dat geproduceerd werd via RAFT (reversible addition fragmentation degenerative chain transfer) polymerisatie aan de hars toegevoegd. Hierdoor werd een RAFT mechanisme geïnduceerd voor 2PP terwijl tot nu toe alleen 2PP werd gerapporteerd in combinatie met een vrij radicalaire polymerisatie. Op deze manier worden er een aantal opties toegevoegd die het toelaten om de 3D structuren te post-modificeren. Verder wordt er meer controle over de mechanische en chemische eigenschappen bekomen. SEM (scanning electron microscopy) bevestigde dat de 3D structuren met succes werden geprint, gebruikmakend van 10 mol% RAFT oligomeer. EDX (energy dispersive x-ray) spectroscopie kon vervolgens de aanwezigheid van trithiocarbonaten vaststellen. Veel belovende, preliminaire resultaten werden bekomen voor de post-modificatie van de structuren via aminolyse van de trithiocarbonaten en daaropvolgende Michael additie van polyethyleen glycol acrylaat. Bij een tweede zij-project werd gebruik gemaakt van de Morita-Baylis-Hillman stap groei polymerisatie voor de productie van dicht gefunctionaliseerde oligomeren. Deze MBH precursoren werden vernet in suspensie via de thiol-een Michael additie om polymeer micropartikels te bekomen. Degradatie experimenten tonen de degradatie aan van de partikels in basisch medium. Toxiciteitstesten bewijzen vervolgens dat deze een goede bio compatibiliteit hebben. Tenslotte werden de partikels, bij wijze van proof of concept, gemodificeerd via de formatie van imines, een populaire reactie voor bio conjugatie.